Plateau technique
Présentation
Le Service d’Ingénierie Génétique bactérienne, labellisé en 2025 par le GIS IBiSA, est basé sur deux sites toulousains (LMGM-CBI et IPBS). Nous sommes chargés de deux missions :
1/ De manière à répondre spécifiquement aux problématiques des équipes de recherche, la plateforme SIG.b conçoit et met en œuvre des approches de génétique moléculaire bactérienne (outils d’ingénierie génétique conventionnels et outils dérivés des systèmes CRISPR) adaptées aux diverses souches bactériennes, qu’il s’agisse de souches modèles ou non, de souches pathogènes ou de souches cliniques.
Nous travaillons en projets collaboratifs avec des équipes de laboratoires publics ou privés, français ou étrangers.
Selon la souche étudiée, nous effectuons une analyse bibliographique approfondie, permettant de proposer une ou plusieurs stratégies d’édition ou de criblage du génome. S’il s’agit d’une souche encore peu caractérisée, nous mettons au point les conditions de culture, de suivi de croissance et de dénombrement, développons les outils appropriés et définissons les protocoles nécessaires à l’introduction de ces outils dans les bactéries.
Nous offrons une possibilité de formation des membres de l’équipe collaborative, à distance ou accueillis sur site pour quelques semaines/mois.
2/ En partenariat avec CNRS Formation Entreprises, SIG.b propose des formations (en français) :
• CRISPRi : une application innovante de CRISPR pour la modulation de l’expression génique chez les bactéries
• Ingénierie du génome associée à CRISPR pour générer des mutations sans cicatrice chez les bactéries
Équipements
Savoir-faire :
Modification du génome bactérien et/ou à modulation de l’expression génique.
• Edition de génomes : Mutation ponctuelle, délétion, insertion (tag), par échange allélique et/ou CRISPR
• Criblage génétique : Isolement de mutants par sélection ou repérage phénotypique (Suppresseur, létalité synthétique…)
• Régulation génique : CRISPR interférence, activation transcriptionnelle, surexpression
• Bio-informatique : Identification de mutations, assemblage de génome post séquençage NGS
Laboratoires de sécurité microbienne
niveaux 1 – 2 – 3
Collections de souches d’Escherichia coli :
• Inactivation de gènes (KEIO)
• Surexpression (ASKA)
• Gènes étiquetés (SPA tag)
Bacteries:
Escherichia coli, Salmonella Typhimurium
Mycoplasma
Mycobacteria
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae, Group B Streptococcus Lactobacillus
etc.
Outils :
• Plasmides et phages pour la recombinaison simple brin ou double brin d’ADN surexpression de gènes
• Outils CRISPR pour clivage simple brin ou double brin d’ADN (contre-sélection des clones « sauvages »), adressage spécifique de fonctions accessoires, édition de bases, etc
• Librairies de gRNA pour CRISPRi, Tn seq (Mariner
Projet 1
Description :
En 2019, SIG.b a entamé une collaboration avec l’équipe IEVA (LMGM) visant à identifier les interacteurs putatifs du complexe BAM. Le Beta-barrel Assembly Machinery (BAM) est un complexe essentiel qui favorise la biogenèse des protéines de la membrane externe des bactéries à Gram négatif. Une approche quantitative de spectrométrie de masse a identifié des interacteurs putatifs de BAM.
Objectifs :
Afin de mieux comprendre la fonction des facteurs d’interaction BAM encore non caractérisés, un criblage CRISPRi a été mis en place pour définir les gènes conférant un défaut de croissance à la bactérie. Ces expériences ont été menées par SIG.b au sein du Laboratoire de biologie de synthèse (Institut Pasteur) qui possède l’expertise en CRISPRi haut débit.
Nous avons validé notre approche à l’échelle du génome en ciblant sélectivement via CRISPRi quelques-uns des gènes trouvés par spectrométrie de masse et en démontrant que l’arrêt de leur expression conduit à une inhibition de croissance.
Nos expériences ont permis de mettre en évidence plusieurs gènes dont des analyses génétiques et biochimiques plus poussées ont montré qu’ils se situent à la croisée de la biogenèse de la membrane externe et de sa dégradation. De tels travaux ont non seulement permis d’élucider le lien entre la voie BAM-dépendante et les processus majeurs de remodelage de l’enveloppe chez E. coli mais également l’acquisition au LMGM d’une méthode de criblage basée sur CRISPRi, aujourd’hui si centrale en microbiologie moléculaire.
Financement :
Les coûts (consommables et frais de mission) ont été pris en charge par l’équipe collaboratrice.
Publication associée :
Elife 2021; doi: 10.7554/eLife.67817. Ranava D, Yang Y, Orenday-Tapia L, Rousset F, Turlan C, Morales V, Cui L, Moulin C, Froment C, Munoz G, Rech J, Marcoux J, Caumont-Sarcos A, Albenne C, Bikard D, Ieva R. Lipoprotein DolP supports proper folding of BamA in the bacterial outer membrane promoting fitness upon envelope
Projet 2
Description :
En 2021, SIG.b a démarré une collaboration avec l’équipe E. Giraud d’InTheRes (ENVT-INRAE Toulouse).
La ciprofloxacine est un antibiotique de la famille des fluoroquinolones (FQ) dont la cible principale est l’ADN gyrase. L’exposition répétée d’une souche sensible, Escherichia.coli ATCC25922, à la ciprofloxacine à des concentrations thérapeutiques a conduit à l’isolement de deux mutants tolérants. Le séquençage du génome (WGS) des mutants a révélé des mutations ponctuelles dans le gène gyrB, l’une des deux sous-unités de l’ADN gyrase.
Objectifs :
Reconstruction de souches par mutagenèse dirigée
– ATCC25922, la souche de référence pour les antibiogrammes utilisée dans cette étude présente une faible capacité à être transformée. Sa transformabilité a été améliorée.
– Nous avons réintroduit dans la souche parentale les mutations révélées par le séquençage, afin de vérifier que ces mutations ponctuelles sont bien responsables des phénotypes de résistance et de tolérance observés.
Financement :
La prestation forfaitaire et les consommables ont été financés par l’équipe INRAE. La doctorante de l’équipe INRAE a été hébergée pendant 6 mois dans le service afin d’être formée à réaliser les expériences de biologie moléculaire et génétique.
Publication associée :
Front Microbiol. 2022; doi: 10.3389/fmicb.2022.908296. Perault A, Turlan C, Eynard N, Vallé Q, Bousquet-Melou A and Giraud E (2022). Repeated Exposure of Escherichia coli to High Ciprofloxacin Concentrations Selects gyrB Mutants That Show Fluoroquinolone-Specific Hyperpersistence.
Projet 3
Internal development (2021) :
Le LMGM a acheté la collection ASKA d’Escherichia coli (clones individuels en format microplaque). Chacune des 4123 ORF prédites d’E. coli W3110 a été amplifié par PCR, inséré dans un plasmide sous le contrôle d’un promoteur inductible par l’IPTG et établi dans la souche AG1 d’E. coli par transformation.
Afin de réaliser des expériences de sélection de suppresseurs multicopies, le service SIG.b a réalisé une librairie de plasmides représentative de cette banque. La librairie a été validée de 2 manières :
– Test de complémentation sur 5 mutants de délétion auxotrophes : transformation avec les sous bibliothèques ASKA et séquençage du contenu plasmidique des colonies résultantes.
– Séquençage direct complet de la librairie plasmidique (Nanopore, prestation externalisée).
Collaborative project (2023, unpublished):
Description :
En 2023, nous avons démarré une collaboration avec C. Albenne (Eq Ieva-LMGM-CBI) visant à comprendre la fonction de la protéine X, une protéine de la membrane externe. La délétion du gène codant pour la protéine X entraîne une sensibilité à la vancomycine.
Objectifs du service :
Notre objectif était d’identifier les suppresseurs phénotypiques dans la librairie plasmidique ASKA par surexpression des plasmides AKSA chez le mutant de délétion du gène X et détection de la résistance à la vancomycine.
Sur 910 plasmides analysés par test individuel, PCR, électrophorèse sur gel et séquençage, une liste de 77 candidats a été fournie à l’équipe collaborative.
Financement :
Les coûts (consommables et frais de séquençage) ont été pris en charge par l’équipe collaboratrice.
– PLoS Pathog. 2023; doi: 10.1371/journal.ppat.1011437
– Front Microbiol. 2022; doi: 10.3389/fmicb.2022.908296
– Elife 2021; doi: 10.7554/eLife.67817
– PLoS One 2020; doi: 10.1371/journal.pone.0226472
Affiliation
