Équipe
ODN
Responsable d’équipe : Gadal Olivier & Beckouet Fredéric
Présentation
Les génomes eucaryotes sont dynamiques et organisés en structures tridimensionnelles à différentes échelles, du nucléosome aux territoires chromosomiques. Ces configurations influencent des processus cruciaux comme la transcription, la réparation de l’ADN et la ségrégation chromosomique. La perturbation de cette organisation 3D est impliquée dans des pathologies, notamment la cancérogenèse. Des translocases telles que les ARN polymérases, les complexes SMC, et les topoisomérases jouent un rôle clé dans cette organisation, bien que leurs interactions et contributions spécifiques restent à élucider.
nous cherchons à répondre à la question centrale :
Comment l’ARN polymérase et les complexes SMC configurent-ils le génome en 3D ?
Comment l’ARN polymérase et les complexes SMC influencent la configuration tridimensionnelle du génome, en utilisant Saccharomyces cerevisiae comme modèle. Nous combinons des approches :
– Génétiques, pour générer des mutants et en analyser les impacts
– Biochimiques et structurales, pour explorer les mécanismes des SMC et ARN polymérases, avec des outils comme les « DNA curtains »
– Moléculaires, via des techniques comme le Hi-C, 3C et la ChIP pour étudier la transcription et le repliement de la chromatine
– Cellulaires, utilisant la microscopie avancée (vidéo, super-résolution, électronique) et des méthodes innovantes comme l’imagerie corrélative (CLEM)
Ces travaux visent à clarifier les mécanismes coordonnant l’organisation 3D du génome et les processus biologiques associés.
Projet 1
Les trois ARN polymérases nucléaires sont des moteurs moléculaires qui influencent la structure du génome. L’ARN polymérase II transcrit la majeure partie du génome, ainsi que tous les ARNm et de nombreux ARN non codants du génome. L’ARN polymérase III transcrit les petits ARN (ARNt, ARNr 5S), tandis que l’ARN polymérase I transcrit un seul gène, le précurseur des grands ARN ribosomiques (ARNr 35S).
Pour comprendre comment l’ARN polymérase contribue à l’organisation du génome, nous concentrons nos recherches sur les mécanismes régulant la synthèse de l’ARN ribosomal par l’ARN polymérase I et analysons leur impact sur l’organisation nucléolaire 3D et la stabilité du génome :
Nous avons identifié plusieurs niveaux de contrôle transcriptionnel :
Un nouveau rôle du facteur d’initiation Rrn3 dans la stabilité génomique et l’accumulation d’une forme non mature de pré-ARNr (Normand et al., 2024). Nos résultats suggèrent que cette fonction inhibitrice de la maturation de l’ARNr a un impact sur la stabilité génomique. Nous continuons à caractériser les mutants Rrn3 afin de dissocier le rôle connu de Rrn3 dans l’initiation de la transcription de cette nouvelle fonction inhibitrice du traitement de l’ARNr.
Un mécanisme d’atténuation de la transcription. En utilisant un mutant favorisant la synthèse de l’ARN, nous avons identifié une terminaison prématurée de la transcription (Azouzi et al., 2023). Nous proposons que cette terminaison régule la synthèse de l’ARNr par atténuation (Azouzi et al., 2021). Nous caractériserons les réarrangements des sous-unités de l’ARN polymérase et les facteurs en trans qui régulent ce processus.
Un nouveau rôle pour le domaine KKE (Dominique et al., 2024). Le nucléole est enrichi d’un domaine protéique riche en KKE, connu sous le nom de région intrinsèquement désordonnée (IDR), capable de former des phases in vitro. En collaboration avec l’équipe Eukarybio (Henry/Henras), nous avons récemment démontré le rôle de ce domaine KKE particulier dans l’organisation et la fonction du nucléole (Dominique et al., 2024). Ces domaines sont également présents sur les sous-unités de l’ARN polymérase I et sur certains facteurs de transcription. Néanmoins, la façon dont ces IDRs régulent l’activité transcriptionnelle et l’organisation 3D du nucléole reste mal comprise. Notre objectif est de mieux comprendre le rôle de ces IDRs dans l’activité et l’organisation du nucléole.
Les outils utilisés pour ces études sont :
Les techniques de quantification de la synthèse des transcrits (CRAC, Run-On, marquage métabolique), l’analyse de l’ARN accumulé (Northern) et la purification des complexes protéiques.
Les outils de biologie cellulaire pour l’étude de la compartimentation nucléaire en relation avec la transcription des gènes comprennent la vidéomicroscopie rapide, la microscopie à super-résolution sur cellules vivantes ou fixées, et la microscopie électronique.
Nous développons des méthodes d’imagerie CLEM (Correlative light and electron microscopy) pour améliorer la résolution de l’imagerie de fluorescence.
Bibliographie
– Azouzi, C., Jaafar, M., Dez, C., Abou Merhi, R., Lesne, A., Henras, A.K., and Gadal, O. (2021). Coupling between production of ribosomal RNA and maturation: just at the beginning. Front. Mol. Biosci. 8, 778778.
– Azouzi, C., Schwank, K., Queille, S., Kwapisz, M., Aguirrebengoa, M., Henras, A., Lebaron, S., Tschochner, H., Lesne, A., Beckouët, F., et al. (2023). Ribosomal RNA synthesis by RNA polymerase I is regulated by premature termination of transcription. BioRxiv.
– Dominique, C., Maiga, N.K., Méndez-Godoy, A., Pillet, B., Hamze, H., Léger-Silvestre, I., Henry, Y., Marchand, V., Neto, V.G., Dez, C., et al. (2024). The dual life of disordered lysine-rich domains of snoRNPs in rRNA modification and nucleolar compaction . Nat. Commun.
– Normand, C., Dez, C., Dauban, L., Queille, S., Danché, S., Abderrahmane, S., Beckouet, F., and Gadal, O. (2024). RNA polymerase I mutant affects ribosomal RNA processing and ribosomal DNA stability. RNA Biol. 21, 1–16.
Projet 2
Les complexes « SMC » (pour « structural maintenance of chromosome ») cohésine, condensine et le complexe SMC5/6 sont des ATPases en forme d’anneau capables de former des boucles d’ADN. Ces boucles sont importantes pour l’organisation tridimensionnelle du génome et la régulation de divers processus biologiques. Une série d’études in vitro a récemment démontré que les complexes SMC forment des boucles d’ADN en capturant de petites boucles et en les élargissant en se déplaçant le long de l’ADN grâce à un moteur moléculaire. Bien que ces études représentent une avancée considérable, les mécanismes régissant la formation de boucles dépendantes des SMC restent mystérieux. Dans notre équipe, nous nous concentrons sur le complexe cohésine. Des études pionnières ont montré que le complexe cohésine est capable de former des boucles d’ADN chez les mammifères pendant l’interphase. Ces boucles sont importantes pour organiser le génome en domaines topologiques (TAD), réguler la transcription des gènes ou contrôler la recombinaison VDJ. Récemment, nous avons démontré que les boucles d’ADN dépendantes de la cohésine organisent également le chromosome mitotique de S. cerevisiae. Nous utilisons donc la levure S. cerevisiae, en profitant du panel de technologies (Hi-C, Chip, microscopie et génétique) pour mettre en évidence les mécanismes moléculaires contrôlant la formation des boucles d’ADN.
QUESTIONS :
Quels sont les mécanismes qui inhibent l’expansion des boucles ?
L’anneau de cohésine n’agit pas seul. Son activité ATPase et son association avec l’ADN sont régulées par un ensemble de protéines auxiliaires : Scc2, Pds5, Wpl1 Scc1 et l’acétyl transférase Eco1. L’utilisation de Hi-C chez les mammifères a démontré que la dissociation des cohésines par la protéine Wpl1 atténue l’expansion des boucles d’ADN. En utilisant Hi-C, nous avons démontré que ce mécanisme est conservé chez S. cerevisiae. Nos études récentes ont également montré que l’expansion des boucles d’ADN est inhibée par d’autres mécanismes indépendants de Wpl1 impliquant Pds5 (Bastié et al., 2022), Eco1 (Dauban et al., 2020) ou la cohésion des chromatides sœurs (Bastié et al., 2024). Un de nos objectifs est de comprendre comment ces protéines auxiliaires exercent leur activité inhibitrice sur l’expansion des boucles d’ADN.
Quels sont les mécanismes qui régissent l’expansion des boucles d’ADN ?
Le facteur Scc2 a été identifié à l’origine comme étant nécessaire à l’association des cohésines sur l’ADN. Récemment, il a été démontré que Scc2 est également nécessaire à l’expansion des boucles d’ADN le long des chromosomes. On pense que Scc2 favorise l’expansion des boucles en stimulant l’activité ATPase nécessaire à la translocation des cohésines sur l’ADN. Nous étudions actuellement les mécanismes régulant la fonction de Scc2 au cours du cycle cellulaire.
Interaction entre la cohésine et l’ARN polymérase (Chapard et al., 2023)
La cohésine se localise principalement entre les gènes en orientation convergente. Sur la base de cette observation, il a été proposé que l’expansion des boucles d’ADN soit causée par l’ARN polymérase qui pousse la cohésine le long de l’ADN. Un autre modèle propose que l’ARN polymérase agisse comme une barrière à l’expansion des boucles. Enfin, un autre modèle propose que la cohésine se charge principalement entre les gènes convergents. Notre laboratoire étudie le rôle de la transcription dans la régulation de l’organisation du génome.
Quelle est la nature de l’interaction entre la cohésine et les boucles d’ADN ?
Le complexe de cohésine a été identifié à l’origine pour son rôle dans la cohésion des chromatides sœurs (SCC) pendant la mitose. Les données du laboratoire de Kim Nasmyth ont démontré que la cohésine assure la CSC en englobant les ADN sœurs dans son anneau (interaction topologique). La nature de l’interaction ADN/cohésine impliquée dans la formation et le maintien des boucles reste à ce jour un mystère. Notre équipe vise à identifier la nature de l’interaction entre la cohésine et les boucles d’ADN, et à déterminer comment des facteurs auxiliaires la régulent.
Bibliographie
– Bastié, N., Chapard, C., Dauban, L., Gadal, O., Beckouët, F., and Koszul, R. (2022). Smc3 acetylation, Pds5 and Scc2 control the translocase activity that establishes cohesin-dependent chromatin loops. Nat. Struct. Mol. Biol. 29, 575–585.
– Bastié, N., Chapard, C., Cournac, A., Nejmi, S., Mboumba, H., Gadal, O., Thierry, A., Beckouët, F., and Koszul, R. (2024). Sister chromatid cohesion halts DNA loop expansion. Mol. Cell 84, 1139–1148.e5.
– Chapard, C., Bastie, N., Cournac, A., Gadal, O., Koszul, R., and Beckouet, F. (2023). Transcription promotes discrete long-range chromatin loops besides organizing cohesin-mediated DNA folding. BioRxiv.
– Dauban, L., Montagne, R., Thierry, A., Lazar-Stefanita, L., Bastié, N., Gadal, O., Cournac, A., Koszul, R., and Beckouët, F. (2020). Regulation of Cohesin-Mediated Chromosome Folding by Eco1 and Other Partners. Mol. Cell 77, 1279–1293.e4.
Membres de l'équipe
– The dual life of disordered lysine-rich domains of snoRNPs in rRNA modification and nucleolar compaction. Dominique C, Maiga NK, Méndez-Godoy A, Pillet B, Hamze H, Léger-Silvestre I, Henry Y, Marchand V, Gomes Neto V, Dez C, Motorin Y, Kressler D, Gadal O, Henras AK, Albert B. Nat Commun. 2024 Oct 31;15(1):9415. doi: 10.1038/s41467-024-53805-1. PMID: 39482307
– RNA polymerase I mutant affects ribosomal RNA processing and ribosomal DNA stability. Normand C, Dez C, Dauban L, Queille S, Danché S, Abderrahmane S, Beckouet F, Gadal O. RNA Biol. 2024 Jan;21(1):1-16. doi: 10.1080/15476286.2024.2381910. PMID: 39049162
– Sister chromatid cohesion halts DNA loop expansion. Bastié N, Chapard C, Cournac A, Nejmi S, Mboumba H, Gadal O, Thierry A, Beckouët F, Koszul R. Mol Cell. 2024 Mar 21;84(6):1139-1148.e5. doi: 10.1016/j.molcel.2024.02.004. PMID: 38452765
– Smc3 acetylation, Pds5 and Scc2 control the translocase activity that establishes cohesin-dependent chromatin loops. Bastié N, Chapard C, Dauban L, Gadal O, Beckouët F, Koszul R. Nat Struct Mol Biol. 2022 Jun;29(6):575-585. doi: 10.1038/s41594-022-00780-0. PMID: 35710835
– Regulation of Cohesin-Mediated Chromosome Folding by Eco1 and Other Partners. Dauban L, Montagne R, Thierry A, Lazar-Stefanita L, Bastié N, Gadal O, Cournac A, Koszul R, Beckouët F. Mol Cell. 2020 Mar 19;77(6):1279-1293.e4. doi: 10.1016/j.molcel.2020.01.019. PMID: 32032532
– Quantification of the dynamic behaviour of ribosomal DNA genes and nucleolus during yeast Saccharomyces cerevisiae cell cycle. Dauban L, Kamgoué A, Wang R, Léger-Silvestre I, Beckouët F, Cantaloube S, Gadal O. J Struct Biol. 2019 Nov 1;208(2):152-164. doi: 10.1016/j.jsb.2019.08.010. PMID: 31449968
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