Équipe
RIBONOVA
Responsable d’équipe : Gleizes Pierre-Emmanuel
Présentation
Les ribosomes assurent la synthèse des protéines dans l’ensemble du monde vivant. Très abondants (5-10 millons/cellule), leur synthèse constitue une part majeure de la dépense énergétique d’une cellule. Les mécanismes de leur production et leur activité forment un « système » complexe et dynamique, organisé dans l’espace de la cellule, au cœur des processus d’expression génique et du métabolisme cellulaire. Ce système est hautement régulé pour s’accorder à l’état de prolifération ou de différentiation de la cellule ou en réponse à différents stress. Le dysfonctionnement de la production et/ou de l’activité des ribosomes est à la source d’un nombre croissant de maladies génétiques rares, appelés ribosomopathies, qui touchent différents tissus. Les travaux de notre équipe portent sur les mécanismes de la formation des ribosomes dans des cellules humaines en considérant la maturation des ARN ribosomiques, l’assemblage des pré-ribosomes, l’organisation du nucléole ou le transport nucléocytoplasmique. Ce cadre mécanistique nous permet de caractériser l’impact fonctionnel de variants de gènes qui perturbent la synthèse ou l’activité des ribosomes dans les ribosomopathies, en particulier l’anémie de Diamond-Blackfan, en vue d’élucider les déterminants physiopathologiques ou d’améliorer le diagnostic. Ce travail est réalisé au travers de collaborations internationales avec des généticiens et des cliniciens. Nous étudions également l’implication du « système ribosome » dans la réponse au stress.
Projet 1
Les ARN ribosomiques structurent les sous-unités ribosomiques et constituent l’essentiel de leur masse. Trois des quatre ARN ribosomiques (ARNr) sont synthétisés sous forme d’un précurseur commun codé par l’ADN ribosomique. La maturation de ce précurseur permet de faire émerger progressivement les ARNr matures en éliminant les séquences qui les encadrent, appelées espaceurs transcrits. Ces étapes de maturation sont coordonnées avec le repliement de l’ARN et l’assemblage des protéines ribosomiques sous le contrôle d’un grand nombre de facteurs de biogenèse des ribosomes. La majeure partie de la biogenèse des ribosomes a lieu dans le noyau, et plus particulièrement dans le nucléole, mais la maturation des particules pré-ribosomiques n’est achevée qu’après l’exportation vers le cytoplasme.
– Rôles des exonucléases 3′-5′ dans a maturation des pré-ARNr humains. Notre équipe et d’autres ont montré les rôles spécifiques des exonucléases 3′-5′ dans le processing du pré-ARNr des mammifères. Ainsi, nous avons identifié la ribonucléase poly-A spécifique (PARN) comme l’enzyme qui assure l’élagage exonucléolytique de l’extrémité 3′ du pré-ARNr 18S-E, le dernier précurseur de l’ARNr 18S (Montellese et al., NAR 2017 ; collaboration : U. Kutay, ETH Zürich, A. Henras CBI). Nous caractérisons actuellement d’autres exonucléases impliquées à différentes étapes de maturation des pré-ARNr humain et comment l’adénylation ou l’uridylation en 3′ de ces ARN contribuent à ce processus (thèse de doctorat de Maxime Aubert ; collaboration : D. Gagliardi &H. Zubert, IBMP Strasbourg).
Les étapes tardives de la biogenèse des ribosomes illustrent le role des exonucléases dans la maturation des pré-ARN ribosomiques
– Contrôle du clivage final de l’extrémité 3′ de l’ARNr 18S par l’endonucléase NOB1 dans le cytoplasme. La maturation de l’extrémité 3′ de l’ARNr 18S a lieu dans le cytoplasme et complète la formation des sous-unités 40S. En utilisant la microscopie cryo-électronique, nous avons résolu la structure des particules pré-40S humaines pendant les étapes tardives de la maturation. Des expériences menées in vitro et in cellulo nous ont permis de proposer que le clivage endonucléolytique par NOB1 sous le double contrôle du facteur de biogenèse des ribosomes RIOK1 et de la protéine ribosomale RPS26, la dernière protéine ribosomique intégrée dans cette sous-unité. (Thèse de doctorat de Laura Plassart ; Plassart et al. eLife 2022 ; collaboration : U. Kutay, ETH Zürich)
Adapté de Plassart et al, eLife, 2022
– Translocation des particules pré-ribosomiques à travers le complexe du pore nucléaire. Les particules préribosomiques sont exportées du noyau à travers le complexe du pore nucléaire (NPC) avec une fréquence élevée. En utilisant la congélation ultrarapide et la tomographie électronique, nous avons capturé des instantanés 3D des particules pré-ribosomiques pendant l’exportation nucléaire. Leur trajectoire au sein du NPC ont pu être analysées sur la base de ces images et déduire des paramètres dynamiques de l’exportation nucléaire des pré-ribosomes à l’aide d’un modèle probabiliste (Delavoie et al. Nat. communication 2019 ; collaboration avec Jean-Yves Dauxois, Institut de Mathématiques de Toulouse). Nous analysons actuellement des souches de levure avec des nucléoporines défectueuses pour étayer plus avant notre modèle de translocation des pré-ribosomes à travers le NPC.
Adapté de Delavoie et al., Nature Communications 2019
Projet 2
La plupart des ribosomopathies sont des maladies congénitales associées à des défauts de synthèse des ribosomes. Le syndrome d’anémie de Diamond-Blackfan (DBAS) est une ribosomopathie prototypique dans laquelle les patients présentent en général une insuffisance médullaire conduisant à un fort défaut de production des globules rouges, ainsi qu’une variété d’autres anomalies du développement. Plus de 95 % des cas ayant fait l’objet d’un diagnostic génétique présentent une haploinsuffisance d’un gène de protéine ribosomique, 24 d’entre eux ayant été associés à la maladie jusqu’à présent. Plusieurs mécanismes physiopathologiques ont été proposés, notamment une altération de la traduction due à un taux plus faible de ribosomes cytoplasmiques ou de ribosomes aberrants, l’effet du stress nucléolaire ou un dérèglement du métabolisme de l’hème. Cependant, la spécificité tissulaire de cette maladie n’a pas encore trouvé d’explication définitive. Il convient de noter que la lésion génétique reste inconnue chez 20 à 30 % des patients après le séquençage du génome. Il s’agit d’un défi de taille, qui est partagé avec d’autres maladies rares et qui nécessite une caractérisation fonctionnelle plus poussée en complément du séquençage à haut débit.
– Nouveaux variants des gènes de la biogénèse des ribosomes liés aux ribosomopathies. Nous collaborons depuis longtemps avec des généticiens du monde entier pour caractériser les variants de gènes impliqués dans la DBA en étudiant leur impact sur la synthèse des ribosomes. Nous avons récemment identifié des variants délétères dans RPL8 et RPL17 (Lebaron et al, Human Mutation 2022 ; Fellmann et al., JCI Insight 2024), les variants RPL17 étant liés à des sous-unités ribosomiques 60S atypiques contenant un ARNr 5,8S tronqué. Dans le cadre du consortium européen RiboEurope (EJPRD), nous avons également identifié des mutations dans HEATR3, un gène chaperon de protéines ribosomiques, dans une nouvelle forme récessive de la maladie associée à une déficience intellectuelle (O’Donohue et al, Blood 2022).
Adapté de O’Donohue et al, Blood, 2022
– Défauts de biogenèse des ribosomes dans les téloméropathies. En collaboration avec l’équipe de Patrick Revy (Imagine, Paris), nous avons étudié les mutations des gènes NHP2 et PARN chez des patients atteints du syndrome de Høyeraal-Hreidarsson (une forme sévère de dyskératose congénitale) ou de fibrose pulmonaire. L’altération de ces deux gènes devrait affecter la télomérase, puisque NHP2 est un composant de la particule de télomérase, et PARN une exonucléase impliquée dans la maturation de TERC, l’ARN de la télomérase. Nous avons constaté qu’en plus du dysfonctionnement des télomères, ces mutations entraînaient des défauts dans la biogenèse des ribosomes, ce qui est cohérent avec leur rôle connu dans la formation des snoRNP et la maturation des pré-ARNr, respectivement. Nous faisons l’hypothèse que ce défaut de synthèse des ribosomes pourrait contribuer au mécanisme pathophysiologique dans ces formes graves de téloméropathies (Benyelles et al, EMBO Mol Med 2019 ; Benyelles et al, Hum Mol Genet 2020).
Adapté de Benyelle et al, EMBO Mol Med, 2020
– Nouvelle méthode d’analyse des pré-ARNr par électrophorèse capillaire pour le diagnostic du DBAS. L’amélioration du diagnostic du DBAS est cruciale pour éviter l’errance diagnostique et fournir les soins adaptés aux patients. Nous avons mis au point un protocole utilisant l’électrophorèse capillaire couplée à la fluorescence induite par laser (CE-LIF) pour détecter les anomalies de maturation des pré-ARNr. Cette méthode a démontré une précision de plus de 85 % dans la distinction entre les patients atteints de DBAS et les individus non malades. Notre objectif actuel est d’automatiser et de standardiser cette approche par le biais d’une solution commerciale afin de la diffuser dans les laboratoires non spécialisés. Ce travail a été réalisé en étroite collaboration avec WinSep et Adelis, deux sociétés basées à Toulouse.
Projet 3
La plupart des étapes de la biogenèse des ribosomes chez les eucaryotes ont lieu dans le nucléole, un domaine nucléaire qui s’organise autour de l’ADN ribosomique (ADNr). Dans les cellules de mammifères, le nucléole adopte une structure tripartite qui reflète le mouvement centrifuge des pré-ribosomes de l’ADNr vers le complexe du pore nucléaire (CPN) au cours de leur maturation. L’auto-organisation du nucléole résulte de la condensation de ses composants, sous l’effet d’une part des interactions fonctionnelles protéine-protéine, protéine-ARN ou ARN-ARN liées à la biogenèse des ribosomes et d’autre part des interactions spontanées de domaines intrinsèquement désordonnés trouvés dans de nombreuses protéines nucléolaires, conduisant à une séparation de phase liquide-liquide. Sous certains stress, comme le choc thermique ou le stress protéotoxique, le nucléole se réorganise en même temps que s’interrompt la biogenèse des ribosomes et que se forment des agrégats de protéines contenant des protéines ribosomiques. Nous collaborons actuellement avec l’équipe de Dimitris Xirodimas (CRBM, Montpellier) pour comprendre les mécanismes conduisant au rétablissement du nucléole après un stress protéotoxique, en particulier le rôle des petits ARN non codants IGS dans ce processus. Nous avons réussi à observer les agrégats protéiques et leur disparition graduelle lors de l’atténuation du stress par microscopie à fluorescence à haute résolution et microscopie corrélative, en collaboration avec les plateaux de microscopie photonique et de microscopie électronique du CBI. L’élimination des agrégats implique les protéasomes nucléaires ainsi que le lncRNA IGS42, qui a été détecté dans les agrégats. Cette étude montre qu’un système de contrôle de la qualité des protéines opère dans le nucléole pendant la récupération du stress afin d’éliminer ces inclusions liées au stress (Brunello et al., EMBO J. 2025).
Tiré de Brunello et al. EMBO J., 2025
Projet 4
Notre équipe est depuis longtemps impliquée dans la mise en œuvre de nouvelles techniques de microscopie électronique, notamment la tomographie électronique, la microscopie corrélative et la cryo-EM, en lien avec le plateau de microscopie électronique du CBI (METi). Nous avons récemment développé un projet de recherche interdisciplinaire avec Etienne Snoeck au CEMES à Toulouse, un laboratoire du CNRS spécialisé en science des matériaux. Ce laboratoire a développé un microscope électronique unique de 300 keV pour faire de l’holographie électronique, une technique spectroscopique permettant l’enregistrement d’images de phase et la détection de potentiels électrostatiques dans des échantillons à des échelles nanométriques. Nous avons combiné notre expertise pour explorer le potentiel de cet instrument à imager des échantillons biologiques à température ambiante ou en mode cryogénique sans aucune coloration. Des images de phages T4 et T5 ont été obtenues en mode hors axe ou en ligne, révélant des capacités prometteuses dans la mesure de potentiels électrostatiques locaux, et permettant d’identifier un certain nombre de problématiques qui devront être résolues à l’avenir pour l’utilisation de cette technique sur des objets biologiques. (Thèse de doctorat d’Elio Karim ; Karim et al., J. Struct. Biol. 2025 ; collaboration : METi)
Adapté de Karim et al., J. Structural Biology, 2025
Membres de l'équipe
– Delavoie F et al. (2019) The path of pre-ribosomes through the nuclear pore complex revealed by electron tomography. Nat. Comm. 10:497
– Plassart L et al. (2021) The final step of 40S ribosomal subunit maturation is controlled by a dual key lock. eLife 10:e6154
– O’Donohue MF et al. (2022) HEATR3 variants impair nuclear import of uL18 (RPL5) and drives a Diamond-Blackfan anemia syndrome in humans. Blood 139:3111-26
– Fellman F, Saunders C, O’Donohue MF et al. (2024) An atypical form of 60S ribosomal subunit in Diamond-Blackfan anemia linked to RPL17 variants. JCI Insight, 9:e172475
– Brunello L et al. (2024) A nuclear protein quality control system for the elimination of nucleolus-related inclusions. EMBO J, online ahead of print (https://doi-org.insb.bib.cnrs.fr/10.1038/s44318-024-00333-9)
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